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ELISA检测技术概述

目    录
第一章   免疫学检测技术发展历史
第二章   ELISA技术基本原理
第三章   ELISA技术基本类型
第四章   ELISA试剂盒基本组成
第五章   ELISA试剂盒样本前处理方法简介
第六章   ELISA技术基本配套仪器
第七章   ELISA技术优缺点
 
第一章   免疫学检测技术发展历史
    免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段,由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示,因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。我国免疫学的检测基本历经了以下几个过程,如图 1.1 所示。
    尽管免疫诊断在临床诊断中占据着非常重要的地位,但是从我国临床免疫诊断现状来看,无论是临床应用方面,还是产业化角度,都处于相对比较落后的状态,亟待改进。下表1.1就此做一比较:
由以上分析不难看出,化学发光免疫检测是大势所趋;而取代进口,发展我国的化学发光检测事业,正是临床检验界着手发展的方向。
 
第二章   ELISA技术基本原理  
      ELISA技术的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。
 
第三章    ELISA技术基本类型
      ELISA技术可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:
(1)固相化的抗原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);
(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);
(3)酶反应的底物。
    根据试剂的来源和样本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。以下主要介绍几种公司常用的检测抗原的类型:
1、间接竞争法测抗原
样本中的待测药物和固相化的抗原共同竞争一定量的抗体,加入酶标记抗抗体(酶标二抗)后能与固相化的抗原抗体复合物特异性结合,经底物显色后检测,样本中药物含量愈高,竞争结合的抗体量愈多,从而结合在固相上的酶标记抗抗体(酶标二抗)量愈少,最后的显色也愈浅。本公司及国内产品多用此法。具体操作步骤如下:
1)抗原固相化:将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原,洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2)加入标准品/样本,再加入抗体,保温反应。样本中药物与固相抗原同时竞争与特异性抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去游离物质及吸附在固相载体上结合不紧密的物质。
3)加酶标抗抗体,固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量与样本中受检药物的量负相关。
4)加底物显色,固相上的酶催化底物成为有色产物。通过仪器检测分析,测知样本中抗原的量。
2、直接竞争法测抗原
(1)直接竞争酶标抗原法测抗原
   样本中的待测药物和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合,经底物显色后检测,样本中药物含量愈高,结合在固相上的酶标抗原量愈少,最后的显色也愈浅。
    (2)直接竞争酶标抗体法测抗原
样本中的待测药物和固相抗原竞争结合一定量的酶标记抗体,经底物显色后检测,样本中药物含量愈高,结合在固相上的酶标抗体愈少,最后显色也愈浅。
    直接竞争法具体操作步骤如下:
1)抗原(或抗体)的固相化:将特异性抗原(或抗体)与固相载体联结,形成固相抗原(或抗体),洗涤除去未结合的抗原(或抗体)及杂质。
2)加入标准品/样本,再加入酶标抗体(或酶标抗原),保温反应。样本中药物与固相抗原(或酶标抗原)同时竞争与特异性抗体(或固相抗体)结合,形成固相抗原-酶标抗体复合物(或抗体-酶标抗原复合物)。洗涤除去游离物质及吸附在固相载体上结合不紧密的物质。
3)加底物显色,固相上的酶催化底物成为有色产物。通过仪器检测分析,测知样本中抗原的量。
本公司目前正致力于研究酶标记抗原和酶标记抗体直接竞争法测定抗原,国外大部分ELISA试剂盒均采用此类型。
3、双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:
1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2) 加受检样本,保温反应,样本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物,洗涤除去其他未结合物质。
3) 加酶标抗体,保温反应,固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合,彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4) 加底物显色,固相上的酶催化底物成为有色产物。通过仪器检测分析,测知样本中抗原的量。
在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检样本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测。
在一步法测定中,当样本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定样本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可
用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型
问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应
性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。
 
第四章   ELISA试剂盒基本组成
完整的ELISA试剂盒包含以下各组分:
(1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);
(2)酶标记的抗原或抗体(结合物);
(3)酶的底物;
(4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中),参考标准品和控制血清(定量测定中);
(5)结合物及样本的稀释液;
(6)洗涤液;
(7)酶反应终止液。
4.1 免疫吸附剂
已包被抗原或抗体的固相载体在低温(2~8℃)干燥的条件下一般可保存6个月。有些不完整的试盒,仅供应包被用抗原或抗体,检测人员需自行包被。以下简述固相载体和包被过程。
4.1.1 固相载体
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器,不参与化学反应。
4.1.2  包被的方式
将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被(coating)。换言之,包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的,靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用力。这种物理吸附是非特异性的,受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的,大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团,故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力,其联结多发生在Fc段上,抗体结合点暴露于外,因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时,抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露,在这种情况下,直接包被效果不佳,可以采用间接的捕获包被法,即先将针对该抗原的特异抗体作预包被,其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面,其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用,包被在固相上的抗原纯度大大提高,因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法,试验的特异性、敏感性均由此得以改善,重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少,仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如,在检测抗DNA抗体时,需用DNA作为包被抗原,而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射(例如30W紫外灯,75cm照射12小时),以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质,如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被,也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被,即用亲和素先包被载体,然后加入生物素化的DNA,这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
4.1.3  包被用抗原 
 兽药残留检测大部分药物因分子量小,难于直接吸附于固相载体上,因此需要将小分子药物经过改造成合适的半抗原,再将半抗原与大分子的载体蛋白偶联(通常是利用半抗原分子中含有一定数量的游离基团,如巯基、氨基、醛基、羧基、酮基、苯酚基、咪唑基等,这些基团可与蛋白质分了中的对应基团在偶联剂的作用下发生偶联反应),从而形成半抗原-载体蛋白复合物,半抗原-载体蛋白复合物通过载体蛋白吸附到固相载体上,实现小分子药物的包被过程。常用的载体蛋白有: 牛血清白蛋白(BSA) 、人血清白蛋白(HSA)、牛的免疫球蛋白(TRP)、鸡的卵清蛋(OVA)、血蓝蛋白(KLH)等。   
    临床用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等,须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取,一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取,蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等(例如AFP从脐带血或胎肝中提取)。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原,多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外,其他杂质少,而且无传染性,但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份,用于ELISA,在反应中可出现假阳性,因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒(HCV)尚不能培养成功,而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCV ELISA中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中,不少重组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇,纯度高,特异性也高,但由于分子量太小,往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质(BSA)等偶联,借助于偶联物与固相载体的吸附,间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇,因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外,某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化,在这种情况下,用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。
4.1.4  包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性,可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质(即便是极微量的),在抗血清中将出现杂抗体,必须除去(可用吸收法)后才能用于ELISA,以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被,应先提取IgG,通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被,高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性,则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高,特异性亦较强,因此不需要作吸收和亲和层析处理,一般可将腹水作适当稀释后直接包被,必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意,一种单抗仅针对一种抗原决定簇,在某些情况下,用多种单抗混合包被,可取得更好的效果。
4.1.5  包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度,包被的温度和时间,包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液,也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后,在4-8℃冰箱中放置过夜,37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化,每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
4.1.6   封闭
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低,吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙,封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙,从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白,也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂,其最大的特点是价廉,可以高浓度使用(5%)。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用,但由于奶粉的成份复杂,而且封闭后的载体不易长期保存,因此在试剂盒的制备中较少应用。 
封闭是否必要,取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA固相均需封闭,封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来,双抗体夹心法,只要酶标记物是高活性的,操作时洗涤彻底,不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时,因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面,业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中,封闭一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或锡袋中,在低温可保存数月。
4.2  结合物
结合物即酶标记的抗体(或抗原),是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化活性,也保持了抗体(或抗原)的免疫活性。结合物中酶与抗体(或抗原)之间有恰当的分子比例,在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的(未结合的)酶或游离的抗体(或抗原)。此外,结合物尚要有良好的稳定性。
4.2.1 酶
用于ELISA的酶应符合以下要求:纯度高,催化反应的转化率高,专一性强,性质稳定,来源丰富,价格便宜,制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同的酶。另外,它的相应底物易于制备和保存,价格低廉,有色产物易于测定等
在ELISA中,常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA试剂中,应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。HRP是一种糖蛋白,含糖量约为18%,分子量为44000,是一种复合酶,由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成,是一种卟啉蛋白质。主酶无色糖蛋白在275nm波长处有最高吸收峰,辅基是深棕色的含铁卟啉环,在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度用RZ(Reinheit Zahl,德文,意为纯度数)表示,是403nm的吸光度与280nm吸光度之比,高纯度的HRP的RZ≥?.0。
HRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外,更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得注意的是,在选用酶制剂时,除其纯度RZ外,更应注意酶的活力。高纯度的酶如保存不当,活力也会降低。酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示,可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验。
国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶(AP)作为标记酶。常用的AP有两个来源,分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特略不相同,从大肠杆菌中提取的AP分子量为80000,酶作用的最适合pH为8.0;用小牛肠膜中提取的AP分子量为100000,最适pH为9.6。在ELISA中,AP系统的敏感度一般高于HRP系统,空白值也较低,但AP价格昂贵,制备结合物所得率也较HRP低。
4.2.2  抗原和抗体
制备结合物时所用抗体一般均为纯度较高的IgG,以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用亲和层析纯的抗体,这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性,可以在高稀释度进行反应,实验结果本底浅淡。如用F(ab')2进行标记,则更可避免标本中RF的干扰。在ELISA中用酶标抗原的模式不多,总的要求是抗原必须是高纯度的。
4.2.3  结合物的制备
酶标记抗体的制备方法主要有两种,即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
(1)戊二醛交联法:戊二醛是一种双功能团试剂,它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸酶一般用此法进行标记。交联方法分一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中,反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效(结合率达60%-70%)和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的,酶与抗体交联时分子间的比例不严格,结合物的大小也不均一,酶与酶,抗体与抗体之间也有可能交联,影响效果。在两步法中,先将酶与戊二醛作用,透析除去多余的戊二醛后,再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用,再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的,较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度,但其偶联的有效率较一步法低。
(2)过碘酸盐氧化法:本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时,过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼,可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结,其最佳比例为:酶/抗体=1~2/1。此法简便有效,一般认为是HRP最可取的标记方法,但也有人认为所用试剂较为强烈,各批实验结果不易重演。 
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上,结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定,因经过彻底洗涤,游离酶可被除去,并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同,它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原,从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化,去除游离的酶和抗体后用于检测,效果更好。纯化的方法很多,分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便,但效果并不理想,因为此法只能去除留在上清中的游离酶,但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取,高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分:游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果,但费用较贵。
结合物制得后,在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物,既不经济,又可使本底增高;结合物的浓度过低,则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时,能维护一个低的本底,并获得测定的最佳灵敏度,达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言,它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时,能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP:抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000,表示该制剂经1:5000稀释后,在与人IgG包被的固相作ELISA试验时,将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中,酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响,因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。
4.2.4 结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质,保存不当,极易失活。高浓度的结合物较为稳定,冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右,但冻干过程中引起活力的减低,而且使用时需经复溶,颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应,配以稀释液临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液,使用时不需再行稀释,在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低,结合物易失活,需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素(例如庆大霉素)和防腐剂(HRP结合物加硫柳泵,AP结合物可加叠氮钠),以防止细菌生长。
4.2.5  结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上,在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如牛血清白蛋白),通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂,如吐温20,0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时,血清标本需稀释后进行测定,也可应用这种稀释液。
4.3  酶的底物
4.3.1  HRP的底物
HRP催化过氧化物的氧化反应,最具代表性的过氧化物为H2O2,其反应式如下:
                      HRP
DH2+H2O2────→D+2H2O
上式中,DH2为供氧体,H2O2为受氢体。在ELISA中,DH2一般为无色化合物,经酶作用后成为有色的产物,以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-
(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的产物呈橙红色,用酸终止酶反应后,在492nm处有最高吸收峰,灵敏度高,比色方便,是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水,OPD•2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性,操作时应予注意。OPD见光易变质,与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定,须现配置现用。在试剂盒中,OPD和H2O2一般分成二组分,OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式,片剂中含有发泡助溶剂,使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中,有制成易保存的浓缩液,使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液。
TMB经HRP作用后共产物显蓝色,目视对比鲜明。TMB性质较稳定,可配成溶液试剂,只需与H2O2溶液混和即成应用液,可直接作底物使用。另外,TMB又有无致癌性等优点,因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后,TMB产物由蓝色呈黄色,可在比色计中定量,最适吸收波长为450nm。
ABTS虽不如OPD和TMB敏感,但空白值极低,也为一些试剂盒所采用。
另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA],
经HRP作用后,产物显荧光,可用荧光光度计测量。用于ELISA的优点为可加宽定量测定的线性范围。
HRP对氢受体的专一性很高,仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。H2O2应用最多,但尿素过氧化物为固体,作为试剂较H2O2方便、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂,用蒸馏水溶解后,在底物缓冲液中密闭、低温(2~8℃)可稳定1年。
4.3.2 AP的底物
AP为磷酸酯酶,一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物,可制成片剂,使用方便。产物为黄色的对硝基酚,在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后,黄色可稳定一定时间。
AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮),可用于ELISA作荧光测定,敏感度较高于用显色底物的比色法。
4.4  洗涤液
在板式ELISA中,常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。
4.5  酶反应终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸,其浓度按加量及比色液的最终体积而异,在板式ELISA中一般采用2mol/L。
4.6 阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控
制品,同时也作为判断结果的对照,因此对照品,特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定,对照品最好也为人血清,因为正常人血清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血清较难得到,国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆(recalcified human plasma)为原料,即在血浆中加入钙离子,使其中的纤维蛋白质凝固,除去凝块后所得的液体,其组成与血清相似。阴性对照品须先行检测,确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg,最好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质,其中加入一定量的待检物质,此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称,在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较,可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml,阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂,以利保存。
4.7 参考标准品
定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的参考标准品,应包括覆盖可检测范围的4-6个浓度,一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。

 
第五章   ELISA试剂盒样本前处理简介
 
一)样本前处理的目的、内容、重要性
1、目的
样本处理的最终目的是将待测组分从样本中分离出来,并达到能够检测的状态。
2、内容
提取、净化是主要的两个内容,也有的需要进行浓缩甚至衍生化。
3、重要性
  据统计,人们常常将60%的时间花在样品前处理上。这不但不符合高效率的要求,而且烦琐的传统样品处理方法也直接影响到最后的分析结果。
二)残留分析的样品种类
    组织(肌肉、肝脏、鱼、虾等)、蜂蜜、蜂王浆、花粉、饲料及其原料、肠衣、熟食、尿样(猪尿、牛尿、羊尿等)、血清(牛血清、猪血清、鸡血清等)、牛奶及奶粉、鸡蛋、粪便等。
三)样本前处理操作一般步骤
1、各种溶液配制
在实验开始前按照说明书的要求配制出各种实验需要的溶液,实验室已有的的溶液也应考虑溶液的配制日期以及有效期
2、样本称量/量取前的处理
有的样本是冷冻保存,有的样本在较低温度时粘度较大在样本且变得不均一,它们称量/量取前必须解冻或加热,夏天采用放置室内解冻即可,冬天可以是防水的温水浴解冻,或24/37度温箱解冻,也可以采用暖气片解冻,但是无论是什么样的方式在解冻完成以后必须立即转到室温环境中来,以免变质,值得一提的是某些药物的实验样本的解冻方式必须使用室温解冻,其他的解冻方式均对结果都有很大的影响
3、样本称量/量取
按照说明书规定的量进行称量/量取,对于外来复核的样本称量/量取应更加的精确,当称量的量很少的情况下可由一般的天平转到分析天平去称量,天平也要按时进行校正部分样本采用量取的方式取样,在量取前必须保证量取容器的准确行;以保证样本量准确
4、样本提取液加入
按照说明书给定的量和试剂/溶液的种类加入到样本中,量少的情况下可以用移液器进行转移,当需要的试剂/溶液量较大的情况下必须用移液管。
注:需要做添加高浓度标准品的样本,在加入提取液之前加入高浓度标准品
5、震/振摇
该步骤有两种方式,一种为长时间的使用震荡器上震荡,该方法可定时定量,但对于某些实验不适用,另一种为较强烈的振荡,可用涡动仪强烈涡动,也可以人为的上下振荡。不同的实验对时间的要求也不同,要按照说明书进行
6、离心
离心有三个影响因素,即为离心力、时间、温度,需要设定的参数就是三个参数,具体的设定方式因离心机不同而有一定的差异,没有条件的情况下要保证时间和离心机转度。
7、取液
1)取上层:这是最为常见和最简单的取液方式,仅仅需要按量取就可以
2)取中间层:最不常见的取液方式,一般情况下是去掉全部上层再吸取中间层,对于一些经验较为丰富的实验员在处理部分实验时可以直接突破上层取中间层
3)取下层:较4是像取中间那样进行,值得注意的是,所有取液方式都有可能遇到取液时液体的量越取越体积越大,甚至吸到移液器内,对于这样的情况在取液时注意看液体的体积达到量就不继续吸就可以了
7、吹干
吹干的三个影响因素为气体、温度、加热方式
气体:较为理想的吹干气体为氮气,出于成本问题多数小规模实验室一般采用空气吹干,
温度:根据药物与提取溶剂的物理性质选择一个合适的温度,一般在50到60℃之间
加热方式:一般有两种方式,分为水浴方式和干浴
8、复溶
吹干以后加入复溶液将药物溶解出来的过程,加速溶解的方式可为涡动溶解和超声溶解,时间时情况而定,一般仅使用涡动溶解
9、样本检测
       该步骤的具体操作见试剂盒说明书中的检测步骤。
四)前处理相关试验术语及定义
1、阴性和阳性
阴性:即样本中不含被检测物质。
阳性:样本中含有被检测物质。
2、假阴性与假阳性
假阴性:因某些因素的影响导致阳性样本检测结果为阴性的现象。
假阳性:因某些因素的影响导致阴性样本检测结果为阳性的现象。
3、灵敏度:试剂盒方法能检测到待测药物的最底浓度。
4、准确度:指测定值(平均值)与真值的接近程度,表示分析结果的真实性。通常用添加回收率来表示:
         回收率=(测定值-空白值)/添加量 ×100%
5、精密度:指用某种方法重复测定同一均质样品测定值彼此接近程度,表示分析结果的重复性,常用变异系数表示。
6、检测限(LOD  limit of detection):检测限指分析方法能够从样本的背景信号中检测出待测物存在时所需的最低浓度。LOD反映了分析方法整体的灵敏度效能指标。一般对分析方法在LOD水平的定量可信性(如精密度、回收率)不作要求,一般要求残留分析方法LOD≦0.1MRL    LOD=B+2SD或B+3SD
7、定量限(LOQ  limit of quantitation):指分析方法能够对样品中的待测物进行定量测定的最低浓度,用于定量方法的验证。
8、残留检测限(MRL)
规定允许食品中药物最高残留量,很多情况下各国规定的MRL值之间有一定的差异,多数情况下我国规定的MRL值较日本、欧盟、美国的高一些。
 
第六章   ELISA技术基本配套仪器
 
1、微孔板酶标仪450nm/630nm
2、旋转蒸发仪/氮气吹干装置
3、均质器
4、振荡器
5、涡旋仪
6、离心机
7、天平:感量0.01g
8、微量移液器:单道 20ml~200ml、100ml~1000ml
多道 250ml
9、超声仪
10、恒温培养箱/生化培养箱
11、冰箱
12、洗板机(可选)
13、磁力搅拌器
第七章   ELISA技术优缺点
 
一)优点
1、检测灵敏度高,可达到ug/kg或ng/kg水平。
2、特异性强。
3、对仪器设备要求不高,测定成本低。
4、方法快速、简便。
5、试剂保存时间较长。
6、自动化程度高。
7、方法种类多。
8、无放射性同位素污染。
二)缺点(潜在危害)
1、在酶标记物的制备和(半)抗原—蛋白质欧联过程中,一些化学物质的毒性很强;但在试剂盒建立成功后,毒性物质已被处理,因此在成品试剂盒使用过程中无雌类毒害问题。
2、在酶免疫测定过程中,酶的底物和生色源或供氢体可能产生毒害效应。

ELISA检测技术概述

目    录
第一章   免疫学检测技术发展历史
第二章   ELISA技术基本原理
第三章   ELISA技术基本类型
第四章   ELISA试剂盒基本组成
第五章   ELISA试剂盒样本前处理方法简介
第六章   ELISA技术基本配套仪器
第七章   ELISA技术优缺点
 
第一章   免疫学检测技术发展历史
    免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段,由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示,因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。我国免疫学的检测基本历经了以下几个过程,如图 1.1 所示。
    尽管免疫诊断在临床诊断中占据着非常重要的地位,但是从我国临床免疫诊断现状来看,无论是临床应用方面,还是产业化角度,都处于相对比较落后的状态,亟待改进。下表1.1就此做一比较:
由以上分析不难看出,化学发光免疫检测是大势所趋;而取代进口,发展我国的化学发光检测事业,正是临床检验界着手发展的方向。
 
第二章   ELISA技术基本原理  
      ELISA技术的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。
 
第三章    ELISA技术基本类型
      ELISA技术可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:
(1)固相化的抗原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);
(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);
(3)酶反应的底物。
    根据试剂的来源和样本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。以下主要介绍几种公司常用的检测抗原的类型:
1、间接竞争法测抗原
样本中的待测药物和固相化的抗原共同竞争一定量的抗体,加入酶标记抗抗体(酶标二抗)后能与固相化的抗原抗体复合物特异性结合,经底物显色后检测,样本中药物含量愈高,竞争结合的抗体量愈多,从而结合在固相上的酶标记抗抗体(酶标二抗)量愈少,最后的显色也愈浅。本公司及国内产品多用此法。具体操作步骤如下:
1)抗原固相化:将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原,洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2)加入标准品/样本,再加入抗体,保温反应。样本中药物与固相抗原同时竞争与特异性抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去游离物质及吸附在固相载体上结合不紧密的物质。
3)加酶标抗抗体,固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量与样本中受检药物的量负相关。
4)加底物显色,固相上的酶催化底物成为有色产物。通过仪器检测分析,测知样本中抗原的量。
2、直接竞争法测抗原
(1)直接竞争酶标抗原法测抗原
   样本中的待测药物和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合,经底物显色后检测,样本中药物含量愈高,结合在固相上的酶标抗原量愈少,最后的显色也愈浅。
    (2)直接竞争酶标抗体法测抗原
样本中的待测药物和固相抗原竞争结合一定量的酶标记抗体,经底物显色后检测,样本中药物含量愈高,结合在固相上的酶标抗体愈少,最后显色也愈浅。
    直接竞争法具体操作步骤如下:
1)抗原(或抗体)的固相化:将特异性抗原(或抗体)与固相载体联结,形成固相抗原(或抗体),洗涤除去未结合的抗原(或抗体)及杂质。
2)加入标准品/样本,再加入酶标抗体(或酶标抗原),保温反应。样本中药物与固相抗原(或酶标抗原)同时竞争与特异性抗体(或固相抗体)结合,形成固相抗原-酶标抗体复合物(或抗体-酶标抗原复合物)。洗涤除去游离物质及吸附在固相载体上结合不紧密的物质。
3)加底物显色,固相上的酶催化底物成为有色产物。通过仪器检测分析,测知样本中抗原的量。
本公司目前正致力于研究酶标记抗原和酶标记抗体直接竞争法测定抗原,国外大部分ELISA试剂盒均采用此类型。
3、双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:
1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2) 加受检样本,保温反应,样本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物,洗涤除去其他未结合物质。
3) 加酶标抗体,保温反应,固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合,彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4) 加底物显色,固相上的酶催化底物成为有色产物。通过仪器检测分析,测知样本中抗原的量。
在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检样本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测。
在一步法测定中,当样本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定样本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可
用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型
问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应
性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。
 
第四章   ELISA试剂盒基本组成
完整的ELISA试剂盒包含以下各组分:
(1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);
(2)酶标记的抗原或抗体(结合物);
(3)酶的底物;
(4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中),参考标准品和控制血清(定量测定中);
(5)结合物及样本的稀释液;
(6)洗涤液;
(7)酶反应终止液。
4.1 免疫吸附剂
已包被抗原或抗体的固相载体在低温(2~8℃)干燥的条件下一般可保存6个月。有些不完整的试盒,仅供应包被用抗原或抗体,检测人员需自行包被。以下简述固相载体和包被过程。
4.1.1 固相载体
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器,不参与化学反应。
4.1.2  包被的方式
将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被(coating)。换言之,包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的,靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用力。这种物理吸附是非特异性的,受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的,大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团,故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力,其联结多发生在Fc段上,抗体结合点暴露于外,因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时,抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露,在这种情况下,直接包被效果不佳,可以采用间接的捕获包被法,即先将针对该抗原的特异抗体作预包被,其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面,其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用,包被在固相上的抗原纯度大大提高,因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法,试验的特异性、敏感性均由此得以改善,重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少,仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如,在检测抗DNA抗体时,需用DNA作为包被抗原,而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射(例如30W紫外灯,75cm照射12小时),以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质,如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被,也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被,即用亲和素先包被载体,然后加入生物素化的DNA,这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
4.1.3  包被用抗原 
 兽药残留检测大部分药物因分子量小,难于直接吸附于固相载体上,因此需要将小分子药物经过改造成合适的半抗原,再将半抗原与大分子的载体蛋白偶联(通常是利用半抗原分子中含有一定数量的游离基团,如巯基、氨基、醛基、羧基、酮基、苯酚基、咪唑基等,这些基团可与蛋白质分了中的对应基团在偶联剂的作用下发生偶联反应),从而形成半抗原-载体蛋白复合物,半抗原-载体蛋白复合物通过载体蛋白吸附到固相载体上,实现小分子药物的包被过程。常用的载体蛋白有: 牛血清白蛋白(BSA) 、人血清白蛋白(HSA)、牛的免疫球蛋白(TRP)、鸡的卵清蛋(OVA)、血蓝蛋白(KLH)等。   
    临床用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等,须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取,一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取,蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等(例如AFP从脐带血或胎肝中提取)。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原,多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外,其他杂质少,而且无传染性,但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份,用于ELISA,在反应中可出现假阳性,因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒(HCV)尚不能培养成功,而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCV ELISA中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中,不少重组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇,纯度高,特异性也高,但由于分子量太小,往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质(BSA)等偶联,借助于偶联物与固相载体的吸附,间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇,因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外,某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化,在这种情况下,用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。
4.1.4  包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性,可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质(即便是极微量的),在抗血清中将出现杂抗体,必须除去(可用吸收法)后才能用于ELISA,以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被,应先提取IgG,通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被,高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性,则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高,特异性亦较强,因此不需要作吸收和亲和层析处理,一般可将腹水作适当稀释后直接包被,必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意,一种单抗仅针对一种抗原决定簇,在某些情况下,用多种单抗混合包被,可取得更好的效果。
4.1.5  包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度,包被的温度和时间,包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液,也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后,在4-8℃冰箱中放置过夜,37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化,每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
4.1.6   封闭
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低,吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙,封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙,从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白,也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂,其最大的特点是价廉,可以高浓度使用(5%)。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用,但由于奶粉的成份复杂,而且封闭后的载体不易长期保存,因此在试剂盒的制备中较少应用。 
封闭是否必要,取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA固相均需封闭,封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来,双抗体夹心法,只要酶标记物是高活性的,操作时洗涤彻底,不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时,因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面,业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中,封闭一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或锡袋中,在低温可保存数月。
4.2  结合物
结合物即酶标记的抗体(或抗原),是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化活性,也保持了抗体(或抗原)的免疫活性。结合物中酶与抗体(或抗原)之间有恰当的分子比例,在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的(未结合的)酶或游离的抗体(或抗原)。此外,结合物尚要有良好的稳定性。
4.2.1 酶
用于ELISA的酶应符合以下要求:纯度高,催化反应的转化率高,专一性强,性质稳定,来源丰富,价格便宜,制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同的酶。另外,它的相应底物易于制备和保存,价格低廉,有色产物易于测定等
在ELISA中,常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA试剂中,应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。HRP是一种糖蛋白,含糖量约为18%,分子量为44000,是一种复合酶,由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成,是一种卟啉蛋白质。主酶无色糖蛋白在275nm波长处有最高吸收峰,辅基是深棕色的含铁卟啉环,在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度用RZ(Reinheit Zahl,德文,意为纯度数)表示,是403nm的吸光度与280nm吸光度之比,高纯度的HRP的RZ≥?.0。
HRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外,更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得注意的是,在选用酶制剂时,除其纯度RZ外,更应注意酶的活力。高纯度的酶如保存不当,活力也会降低。酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示,可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验。
国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶(AP)作为标记酶。常用的AP有两个来源,分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特略不相同,从大肠杆菌中提取的AP分子量为80000,酶作用的最适合pH为8.0;用小牛肠膜中提取的AP分子量为100000,最适pH为9.6。在ELISA中,AP系统的敏感度一般高于HRP系统,空白值也较低,但AP价格昂贵,制备结合物所得率也较HRP低。
4.2.2  抗原和抗体
制备结合物时所用抗体一般均为纯度较高的IgG,以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用亲和层析纯的抗体,这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性,可以在高稀释度进行反应,实验结果本底浅淡。如用F(ab')2进行标记,则更可避免标本中RF的干扰。在ELISA中用酶标抗原的模式不多,总的要求是抗原必须是高纯度的。
4.2.3  结合物的制备
酶标记抗体的制备方法主要有两种,即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
(1)戊二醛交联法:戊二醛是一种双功能团试剂,它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸酶一般用此法进行标记。交联方法分一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中,反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效(结合率达60%-70%)和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的,酶与抗体交联时分子间的比例不严格,结合物的大小也不均一,酶与酶,抗体与抗体之间也有可能交联,影响效果。在两步法中,先将酶与戊二醛作用,透析除去多余的戊二醛后,再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用,再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的,较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度,但其偶联的有效率较一步法低。
(2)过碘酸盐氧化法:本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时,过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼,可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结,其最佳比例为:酶/抗体=1~2/1。此法简便有效,一般认为是HRP最可取的标记方法,但也有人认为所用试剂较为强烈,各批实验结果不易重演。 
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上,结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定,因经过彻底洗涤,游离酶可被除去,并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同,它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原,从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化,去除游离的酶和抗体后用于检测,效果更好。纯化的方法很多,分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便,但效果并不理想,因为此法只能去除留在上清中的游离酶,但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取,高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分:游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果,但费用较贵。
结合物制得后,在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物,既不经济,又可使本底增高;结合物的浓度过低,则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时,能维护一个低的本底,并获得测定的最佳灵敏度,达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言,它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时,能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP:抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000,表示该制剂经1:5000稀释后,在与人IgG包被的固相作ELISA试验时,将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中,酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响,因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。
4.2.4 结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质,保存不当,极易失活。高浓度的结合物较为稳定,冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右,但冻干过程中引起活力的减低,而且使用时需经复溶,颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应,配以稀释液临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液,使用时不需再行稀释,在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低,结合物易失活,需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素(例如庆大霉素)和防腐剂(HRP结合物加硫柳泵,AP结合物可加叠氮钠),以防止细菌生长。
4.2.5  结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上,在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如牛血清白蛋白),通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂,如吐温20,0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时,血清标本需稀释后进行测定,也可应用这种稀释液。
4.3  酶的底物
4.3.1  HRP的底物
HRP催化过氧化物的氧化反应,最具代表性的过氧化物为H2O2,其反应式如下:
                      HRP
DH2+H2O2────→D+2H2O
上式中,DH2为供氧体,H2O2为受氢体。在ELISA中,DH2一般为无色化合物,经酶作用后成为有色的产物,以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-
(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的产物呈橙红色,用酸终止酶反应后,在492nm处有最高吸收峰,灵敏度高,比色方便,是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水,OPD•2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性,操作时应予注意。OPD见光易变质,与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定,须现配置现用。在试剂盒中,OPD和H2O2一般分成二组分,OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式,片剂中含有发泡助溶剂,使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中,有制成易保存的浓缩液,使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液。
TMB经HRP作用后共产物显蓝色,目视对比鲜明。TMB性质较稳定,可配成溶液试剂,只需与H2O2溶液混和即成应用液,可直接作底物使用。另外,TMB又有无致癌性等优点,因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后,TMB产物由蓝色呈黄色,可在比色计中定量,最适吸收波长为450nm。
ABTS虽不如OPD和TMB敏感,但空白值极低,也为一些试剂盒所采用。
另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA],
经HRP作用后,产物显荧光,可用荧光光度计测量。用于ELISA的优点为可加宽定量测定的线性范围。
HRP对氢受体的专一性很高,仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。H2O2应用最多,但尿素过氧化物为固体,作为试剂较H2O2方便、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂,用蒸馏水溶解后,在底物缓冲液中密闭、低温(2~8℃)可稳定1年。
4.3.2 AP的底物
AP为磷酸酯酶,一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物,可制成片剂,使用方便。产物为黄色的对硝基酚,在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后,黄色可稳定一定时间。
AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮),可用于ELISA作荧光测定,敏感度较高于用显色底物的比色法。
4.4  洗涤液
在板式ELISA中,常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。
4.5  酶反应终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸,其浓度按加量及比色液的最终体积而异,在板式ELISA中一般采用2mol/L。
4.6 阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控
制品,同时也作为判断结果的对照,因此对照品,特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定,对照品最好也为人血清,因为正常人血清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血清较难得到,国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆(recalcified human plasma)为原料,即在血浆中加入钙离子,使其中的纤维蛋白质凝固,除去凝块后所得的液体,其组成与血清相似。阴性对照品须先行检测,确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg,最好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质,其中加入一定量的待检物质,此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称,在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较,可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml,阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂,以利保存。
4.7 参考标准品
定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的参考标准品,应包括覆盖可检测范围的4-6个浓度,一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。

 
第五章   ELISA试剂盒样本前处理简介
 
一)样本前处理的目的、内容、重要性
1、目的
样本处理的最终目的是将待测组分从样本中分离出来,并达到能够检测的状态。
2、内容
提取、净化是主要的两个内容,也有的需要进行浓缩甚至衍生化。
3、重要性
  据统计,人们常常将60%的时间花在样品前处理上。这不但不符合高效率的要求,而且烦琐的传统样品处理方法也直接影响到最后的分析结果。
二)残留分析的样品种类
    组织(肌肉、肝脏、鱼、虾等)、蜂蜜、蜂王浆、花粉、饲料及其原料、肠衣、熟食、尿样(猪尿、牛尿、羊尿等)、血清(牛血清、猪血清、鸡血清等)、牛奶及奶粉、鸡蛋、粪便等。
三)样本前处理操作一般步骤
1、各种溶液配制
在实验开始前按照说明书的要求配制出各种实验需要的溶液,实验室已有的的溶液也应考虑溶液的配制日期以及有效期
2、样本称量/量取前的处理
有的样本是冷冻保存,有的样本在较低温度时粘度较大在样本且变得不均一,它们称量/量取前必须解冻或加热,夏天采用放置室内解冻即可,冬天可以是防水的温水浴解冻,或24/37度温箱解冻,也可以采用暖气片解冻,但是无论是什么样的方式在解冻完成以后必须立即转到室温环境中来,以免变质,值得一提的是某些药物的实验样本的解冻方式必须使用室温解冻,其他的解冻方式均对结果都有很大的影响
3、样本称量/量取
按照说明书规定的量进行称量/量取,对于外来复核的样本称量/量取应更加的精确,当称量的量很少的情况下可由一般的天平转到分析天平去称量,天平也要按时进行校正部分样本采用量取的方式取样,在量取前必须保证量取容器的准确行;以保证样本量准确
4、样本提取液加入
按照说明书给定的量和试剂/溶液的种类加入到样本中,量少的情况下可以用移液器进行转移,当需要的试剂/溶液量较大的情况下必须用移液管。
注:需要做添加高浓度标准品的样本,在加入提取液之前加入高浓度标准品
5、震/振摇
该步骤有两种方式,一种为长时间的使用震荡器上震荡,该方法可定时定量,但对于某些实验不适用,另一种为较强烈的振荡,可用涡动仪强烈涡动,也可以人为的上下振荡。不同的实验对时间的要求也不同,要按照说明书进行
6、离心
离心有三个影响因素,即为离心力、时间、温度,需要设定的参数就是三个参数,具体的设定方式因离心机不同而有一定的差异,没有条件的情况下要保证时间和离心机转度。
7、取液
1)取上层:这是最为常见和最简单的取液方式,仅仅需要按量取就可以
2)取中间层:最不常见的取液方式,一般情况下是去掉全部上层再吸取中间层,对于一些经验较为丰富的实验员在处理部分实验时可以直接突破上层取中间层
3)取下层:较4是像取中间那样进行,值得注意的是,所有取液方式都有可能遇到取液时液体的量越取越体积越大,甚至吸到移液器内,对于这样的情况在取液时注意看液体的体积达到量就不继续吸就可以了
7、吹干
吹干的三个影响因素为气体、温度、加热方式
气体:较为理想的吹干气体为氮气,出于成本问题多数小规模实验室一般采用空气吹干,
温度:根据药物与提取溶剂的物理性质选择一个合适的温度,一般在50到60℃之间
加热方式:一般有两种方式,分为水浴方式和干浴
8、复溶
吹干以后加入复溶液将药物溶解出来的过程,加速溶解的方式可为涡动溶解和超声溶解,时间时情况而定,一般仅使用涡动溶解
9、样本检测
       该步骤的具体操作见试剂盒说明书中的检测步骤。
四)前处理相关试验术语及定义
1、阴性和阳性
阴性:即样本中不含被检测物质。
阳性:样本中含有被检测物质。
2、假阴性与假阳性
假阴性:因某些因素的影响导致阳性样本检测结果为阴性的现象。
假阳性:因某些因素的影响导致阴性样本检测结果为阳性的现象。
3、灵敏度:试剂盒方法能检测到待测药物的最底浓度。
4、准确度:指测定值(平均值)与真值的接近程度,表示分析结果的真实性。通常用添加回收率来表示:
         回收率=(测定值-空白值)/添加量 ×100%
5、精密度:指用某种方法重复测定同一均质样品测定值彼此接近程度,表示分析结果的重复性,常用变异系数表示。
6、检测限(LOD  limit of detection):检测限指分析方法能够从样本的背景信号中检测出待测物存在时所需的最低浓度。LOD反映了分析方法整体的灵敏度效能指标。一般对分析方法在LOD水平的定量可信性(如精密度、回收率)不作要求,一般要求残留分析方法LOD≦0.1MRL    LOD=B+2SD或B+3SD
7、定量限(LOQ  limit of quantitation):指分析方法能够对样品中的待测物进行定量测定的最低浓度,用于定量方法的验证。
8、残留检测限(MRL)
规定允许食品中药物最高残留量,很多情况下各国规定的MRL值之间有一定的差异,多数情况下我国规定的MRL值较日本、欧盟、美国的高一些。
 
第六章   ELISA技术基本配套仪器
 
1、微孔板酶标仪450nm/630nm
2、旋转蒸发仪/氮气吹干装置
3、均质器
4、振荡器
5、涡旋仪
6、离心机
7、天平:感量0.01g
8、微量移液器:单道 20ml~200ml、100ml~1000ml
多道 250ml
9、超声仪
10、恒温培养箱/生化培养箱
11、冰箱
12、洗板机(可选)
13、磁力搅拌器
第七章   ELISA技术优缺点
 
一)优点
1、检测灵敏度高,可达到ug/kg或ng/kg水平。
2、特异性强。
3、对仪器设备要求不高,测定成本低。
4、方法快速、简便。
5、试剂保存时间较长。
6、自动化程度高。
7、方法种类多。
8、无放射性同位素污染。
二)缺点(潜在危害)
1、在酶标记物的制备和(半)抗原—蛋白质欧联过程中,一些化学物质的毒性很强;但在试剂盒建立成功后,毒性物质已被处理,因此在成品试剂盒使用过程中无雌类毒害问题。
2、在酶免疫测定过程中,酶的底物和生色源或供氢体可能产生毒害效应。

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